病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)在兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病中的合理應(yīng)用

呼吸系統(tǒng)感染性疾病是兒童最常見(jiàn)的感染性疾病，肺炎是5歲以下兒童病死的首位原因，嚴(yán)重威脅兒童生命健康。

呼吸系統(tǒng)感染的病原種類繁多，且不同病原感染臨床表現(xiàn)有相似之處，給臨床診療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。

對(duì)嚴(yán)重的下呼吸道感染患者，臨床醫(yī)生早期通常會(huì)在病原未明的情況下經(jīng)驗(yàn)性使用廣譜抗菌藥物治療。

廣泛的經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素不僅增加了相關(guān)不良作用和醫(yī)療費(fèi)用，更會(huì)增加細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)。

病原體的快速鑒定是兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病早期診斷和合理用藥的基礎(chǔ)，對(duì)指導(dǎo)臨床診療十分重要。

為規(guī)范兒童呼吸系統(tǒng)感染病原體檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用，提升病原體的診斷水平，本文對(duì)病原體檢測(cè)常用檢測(cè)技術(shù)在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行論述，以指導(dǎo)兒童呼吸系統(tǒng)感染病原體檢測(cè)技術(shù)的合理應(yīng)用，提升兒童呼吸系統(tǒng)感染的病原診斷能力。

病毒抗原檢測(cè)適于早期篩查，多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)助力呼吸道病毒的快速和精準(zhǔn)診斷

口咽拭子和鼻咽拭子的膠體金法病毒抗原檢測(cè)是病毒檢測(cè)較為常用的手段，方法簡(jiǎn)便，無(wú)檢測(cè)環(huán)境和人員的要求，約30min即可出結(jié)果，且檢測(cè)成本較低，特異度較高，推薦應(yīng)用于門(mén)急診呼吸道病毒感染的早期篩查，對(duì)臨床決策指導(dǎo)合理用藥意義較大。

但由于取材來(lái)源和樣本病毒量不穩(wěn)定及檢測(cè)技術(shù)本身的問(wèn)題，敏感性低。

病毒核酸檢測(cè)可在較短時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，敏感度和特異度較高，并可鑒定病毒亞型及檢測(cè)病毒相對(duì)載量。

病毒核酸檢測(cè)可用于不同呼吸道樣本，包括鼻咽、口咽分泌物、痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液和活檢肺組織等。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是最常用的方法。

多重PCR是在普通PCR技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，可同時(shí)檢測(cè)多種病原體，對(duì)樣本量的要求較低，檢測(cè)時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏度、高特異性檢測(cè)，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。

一項(xiàng)涉及5510個(gè)樣本的薈萃分析顯示多重PCR檢測(cè)病毒靈敏度和特異性分別為94.0%和98.7%，與傳統(tǒng)檢測(cè)（例如快速抗原檢測(cè)和病毒培養(yǎng)）相比，多重分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性更高。

然而，它的多引物設(shè)計(jì)會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率增加，其對(duì)殘留污染檢出率較高也對(duì)實(shí)驗(yàn)室封閉反應(yīng)系統(tǒng)提出了更高的要求，尚不適用于實(shí)驗(yàn)室條件相對(duì)不足的基層醫(yī)院。

多重PCR檢測(cè)技術(shù)是目前臨床最常用的可靠方法，可用于門(mén)急診和住院患兒的早期快速病毒診斷，在高度懷疑病毒感染、病毒抗原快速檢測(cè)陰性時(shí)也有重要作用。

機(jī)體感染病毒后首先出現(xiàn)特異性免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM）升高，特異性IgM抗體檢測(cè)可用于門(mén)診、急診或基層醫(yī)院的病原體篩查。

但機(jī)體產(chǎn)生IgM在感染后1周左右，早期陽(yáng)性率低。

另外，感染后IgM可持續(xù)3～6個(gè)月甚至更久，檢測(cè)陽(yáng)性需結(jié)合臨床做出判斷[7]。

血清IgG抗體檢測(cè)需采集急性期及恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行比較，且體液免疫缺陷的患者可呈假陰性，因此早期診斷價(jià)值有限。

病毒分離培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，特異度高，可進(jìn)行病毒鑒定分型，但其實(shí)驗(yàn)要求高，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且敏感度差，不適合臨床常規(guī)開(kāi)展。

病原培養(yǎng)是協(xié)助臨床診斷細(xì)菌感染最常用、最可靠的手段

呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)協(xié)助診斷細(xì)菌感染仍是臨床應(yīng)用的主流方法，可取下呼吸道分泌物、胸腔穿刺液、肺活檢組織等標(biāo)本進(jìn)行病原培養(yǎng)和分離，并對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而指導(dǎo)臨床治療。

對(duì)于社區(qū)獲得性肺炎，早期痰液培養(yǎng)是目前臨床最常用的方法。

肺泡灌洗液培養(yǎng)是明確細(xì)菌性肺炎的重要依據(jù)，因有創(chuàng)性檢查，推薦用于經(jīng)驗(yàn)抗生素治療無(wú)效的肺炎、重癥肺炎、免疫功能低下等患兒。

但細(xì)菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，且抗生素應(yīng)用會(huì)使培養(yǎng)的敏感性降低，常需聯(lián)合其他檢測(cè)方法來(lái)明確診斷。

涂片染色鏡檢亦是發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染的重要方法，它的優(yōu)點(diǎn)是快速、直觀、成本低，臨床易于開(kāi)展，推薦呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)前常規(guī)進(jìn)行涂片染色鏡檢，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)感染病原菌有一定的指導(dǎo)意義。

某些細(xì)菌感染還可進(jìn)行快速抗原檢測(cè)。

如尿肺炎鏈球菌抗原在發(fā)病1d內(nèi)即可被檢測(cè)到，且兒童尿標(biāo)本簡(jiǎn)單易獲取，對(duì)于呼吸道感染的兒童可通過(guò)測(cè)定尿抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)肺炎鏈球菌的快速、早期診斷。

銅綠假單胞菌是下呼吸道感染常見(jiàn)致病菌，特別是醫(yī)院獲得性肺炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎以及支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化等患者，多重耐藥銅綠假單胞菌導(dǎo)致的下呼吸道感染與更高的病死率有關(guān)。

以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法可直接檢測(cè)耐藥基因，也可通過(guò)檢測(cè)不同藥物濃度下目的基因擴(kuò)增推斷該抗菌藥物濃度是否有效，還可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)不同藥物濃度下目的基因轉(zhuǎn)錄水平評(píng)估細(xì)菌的耐藥性。

qPCR檢測(cè)速度快，但耐藥表型可能涉及多種基因突變及表達(dá)，僅檢測(cè)單一耐藥基因可能無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)耐藥表型。

上呼吸道樣本的PCR檢測(cè)對(duì)百日咳感染的診斷有重要意義，具有快速、準(zhǔn)確、敏感度高（>90%）、特異性強(qiáng)（>95%）等特點(diǎn)，特別適合嬰幼兒及未接受免疫接種的兒童及咳嗽<2周的患者。

咽拭子細(xì)菌培養(yǎng)是百日咳的標(biāo)準(zhǔn)檢查方法，特異度100%，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)且敏感性低，特別是對(duì)經(jīng)過(guò)抗生素治療或標(biāo)本采集時(shí)間過(guò)晚的患兒，可作為分子檢測(cè)方法的補(bǔ)充，可用于分子檢測(cè)陽(yáng)性及沒(méi)有條件開(kāi)展分子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是目前診斷肺炎支原體感染的首選方法

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）培養(yǎng)是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，特異度高，且可通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)判斷是否為耐藥菌，但需特定培養(yǎng)基，且程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度較低，不能滿足臨床快速診斷的需求。

MP血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)肺炎支原體感染的方法，但MP-IgM在感染后約1周檢測(cè)到，無(wú)法早期診斷，在一定程度上會(huì)影響重癥和/或難治性病例的早期干預(yù)。

膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)法可定性檢測(cè)MP-Ig M，試驗(yàn)結(jié)果可在5～10min內(nèi)通過(guò)肉眼進(jìn)行觀察，該檢測(cè)方法無(wú)需任何儀器設(shè)備，具有方便、快速、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，但報(bào)告結(jié)果只顯示陰性或陽(yáng)性，不能報(bào)告滴度，適宜在一般基層醫(yī)院和門(mén)急診快速篩查開(kāi)展應(yīng)用。

顆粒凝集法通過(guò)檢測(cè)恢復(fù)期和急性期MP抗體滴度呈4倍及以上增高或減低時(shí)可以確診肺炎支原體感染，難以用于急性感染的早期診斷。

MP抗原檢測(cè)特異度和靈敏度均較高，且無(wú)需專業(yè)儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單快速，在早期和快速檢測(cè)中具有潛在臨床價(jià)值，但其具有高特異度和高假陰性的特點(diǎn)，更適用肺炎支原體感染的初篩。

MP分子檢測(cè)技術(shù)主要為核酸擴(kuò)增技術(shù)，包括DNA擴(kuò)增和RNA擴(kuò)增，具有周轉(zhuǎn)時(shí)間快、污染可能性低、靈敏度高、特異度高、不受時(shí)間和免疫功能限制等優(yōu)點(diǎn)，已被認(rèn)為是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)PCR法還可直接檢測(cè)呼吸道標(biāo)本耐藥基因突變，獲得結(jié)果快，在臨床得到廣泛應(yīng)用。

基因點(diǎn)突變導(dǎo)致的靶點(diǎn)改變是MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的最重要原因，23S rRNA對(duì)結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)和V區(qū)與抗生素直接結(jié)合的堿基點(diǎn)突變可導(dǎo)致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥，可通過(guò)測(cè)定23S rRNA的2063、2064等位點(diǎn)突變判斷耐藥與否。

但所檢測(cè)的耐藥狀況與臨床療效并不完全一致，臨床結(jié)局可能還與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用以及病程自限等因素有關(guān)。

檢驗(yàn)新技術(shù)助力結(jié)核病的快速診斷

結(jié)核分枝桿菌最常用的檢測(cè)方法是涂片法，痰涂片是一種快速低廉、操作簡(jiǎn)便、被臨床廣泛應(yīng)用的方法，但該方法無(wú)法區(qū)分死菌和活菌，尤其是無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，且受制于痰液中分枝桿菌數(shù)量，敏感性較低。

結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性是診斷結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，與痰涂片相比，培養(yǎng)法雖然靈敏度增加不少，但檢測(cè)周期太長(zhǎng)，不但貽誤治療，也增加了傳播時(shí)間。

結(jié)核分枝桿菌抗原陽(yáng)性可作為結(jié)核感染的直接證據(jù)，且不受結(jié)核病患者免疫狀態(tài)的影響。

由于單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展，目前已可制備高效價(jià)的特異性抗體，使檢測(cè)血清中的結(jié)核桿菌抗原成為結(jié)核診斷的新方法。

結(jié)核菌素試驗(yàn)是檢測(cè)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌免疫反應(yīng)的經(jīng)典方法，具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)結(jié)果受卡介苗接種及人體免疫狀態(tài)的影響，在嚴(yán)重播散性結(jié)核病和免疫抑制兒童患兒中常出現(xiàn)假陰性。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)是通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染；特異度高，不受卡介苗接種及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的干擾，且使用外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)不接觸活菌，減少了人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。

但γ-干擾素釋放試驗(yàn)不能很好區(qū)分是活動(dòng)性結(jié)核與陳舊性結(jié)核。

實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌核酸，可提升結(jié)核桿菌的檢出率，準(zhǔn)確率和敏感度均較高，結(jié)果與分離培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果有較高的一致性。

以RNA為檢測(cè)靶標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)方法使用16S rRNA為靶標(biāo)，其靈敏度和特異度很高，是目前市場(chǎng)上唯一可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

GeneXpert是一種全自動(dòng)化分子診斷系統(tǒng)，是以結(jié)核分枝桿菌的RNA聚合酶活性位點(diǎn)編碼區(qū)為靶標(biāo)，采用半巢式實(shí)時(shí)半定量PCR進(jìn)行病原體檢測(cè)的方法。

對(duì)于臨床疑似肺結(jié)核患兒、耐多藥肺結(jié)核患兒，GeneXpert可先于抗酸染色或細(xì)菌培養(yǎng)作為初篩方法。

目前，GeneXpert技術(shù)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌主要為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群快速分子鑒定及利福平耐藥性檢測(cè)（GeneXpert MTB/RIF)，GeneXpert MTB/RIF是通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組中的rpoB基因及其突變情況，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌核酸和利福平耐藥檢測(cè)的全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)。

它具有以下優(yōu)勢(shì)：特異性好，能準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌；靈敏度高，檢測(cè)快速，僅需要2h就完成檢查了，適用于各種標(biāo)本，如痰液、肺泡灌洗液、肺組織、腦脊液、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液以及尿液等均可用于檢測(cè)；同時(shí)可以檢測(cè)利福平耐藥，檢測(cè)對(duì)一線抗結(jié)核藥物利福平的耐藥情況，敏感性特異性極高。

GeneXpert MTB/RIF還可以應(yīng)用于肺外結(jié)核及兒童結(jié)核的診斷，但不足的是該系統(tǒng)的設(shè)備和試劑盒成本均較高，故短期內(nèi)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)其在基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行普及使用。

多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用協(xié)助真菌的診斷

可引起肺部真菌感染的病原體種類較多，比較常見(jiàn)的包括隱球菌屬、曲霉屬、毛霉屬、肺孢子菌屬等。

顯微鏡檢法檢測(cè)真菌操作簡(jiǎn)便、快速，不需要特殊儀器設(shè)備，適合在各級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，但靈敏度相對(duì)較低，病原菌數(shù)量少時(shí)難以發(fā)現(xiàn)，且需要臨床人員有一定的臨床檢驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)。

分離培養(yǎng)是診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但部分真菌培養(yǎng)困難，如毛霉目，有時(shí)顯微鏡檢可見(jiàn)大量菌絲，但培養(yǎng)陽(yáng)性率不高，特別是呼吸道標(biāo)本處理不當(dāng)常導(dǎo)致毛霉目真菌菌體被損壞，生長(zhǎng)困難。

另外，曲霉屬與毛霉目真菌在周?chē)h(huán)境中可見(jiàn)，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植。

因此，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性者應(yīng)結(jié)合臨床以區(qū)分真菌感染、環(huán)境污染及呼吸道定植。

肺部真菌感染常用的免疫學(xué)診斷試驗(yàn)包括1，3-β-D葡聚糖試驗(yàn)（G試驗(yàn)）、半乳甘露聚糖抗原試驗(yàn)、曲霉免疫球蛋白G抗體試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原試驗(yàn)等。

G試驗(yàn)可檢測(cè)隱球菌和接合菌以外的真菌，陰性結(jié)果意義較大，可排除判斷未發(fā)生隱球菌和接合菌以外的真菌感染；但受飲食、藥物如白蛋白、抗菌藥物等影響較大，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，需根據(jù)臨床情況進(jìn)行判定。

半乳甘露聚糖抗原試驗(yàn)主要用于輔助診斷侵襲性肺曲霉病，在中性粒細(xì)胞缺乏患者中易出現(xiàn)假陰性。

隱球菌莢膜多糖抗原試驗(yàn)在診斷隱球菌感染中具有極重要的價(jià)值，對(duì)于肺隱球菌病，支氣管肺泡灌洗液的隱球菌抗原檢測(cè)有高度的特異度和敏感度。

曲霉免疫球蛋白G抗體試驗(yàn)在超敏反應(yīng)性支氣管肺曲霉病與慢性肺曲霉病診斷中有較好的應(yīng)用價(jià)值。

目前最常見(jiàn)的檢測(cè)真菌感染的分子生物學(xué)方法是PCR，但其在真菌檢測(cè)中的應(yīng)用相對(duì)較少，主要原因在于真菌的細(xì)胞壁較厚，常規(guī)方法下核酸提取困難。

近年來(lái)，宏基因組二代測(cè)序的出現(xiàn)及臨床應(yīng)用為肺部真菌感染的診斷提供了非常重要的手段，使臨床診斷下呼吸道真菌感染的方法更加豐富，具有重要的臨床價(jià)值。

宏基因組二代測(cè)序是兒童疑難、重癥呼吸系統(tǒng)感染性疾病病原診斷的重要補(bǔ)充

宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next generation sequencing，m NGS）技術(shù)是近年來(lái)興起的非序列依賴的新型核酸檢測(cè)方法，由于其非預(yù)設(shè)性、高通量等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。

m NGS無(wú)需事先對(duì)樣本進(jìn)行特異性擴(kuò)增，且能夠無(wú)偏倚地在同一樣本中同時(shí)檢測(cè)已知或者未知的細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒，還能明確微生物的抗生素耐藥情況。

在未知病原菌的感染性疾病暴發(fā)調(diào)查、傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果陰性的感染患者、免疫缺陷患者及危重癥感染患者的應(yīng)用中均已證明了mNGS的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

可檢測(cè)的標(biāo)本包括血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等。

與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)比較，mNGS對(duì)標(biāo)本選擇不具有偏向性，且靈敏度特異度高、通量高，可有效發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷。

對(duì)于兒童呼吸道感染，在病因不明且病情危重需要盡快明確病原體、疑似新發(fā)或特殊病原體感染、傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)多次陰性且治療效果不佳等情況下，可以在常規(guī)病原檢測(cè)的同時(shí)或在其基礎(chǔ)上對(duì)樣本進(jìn)行mNGS分析，以高效獲取感染病原體的信息。

在檢出細(xì)菌及真菌方面，肺泡灌洗液標(biāo)本具有更高的敏感性，而在檢測(cè)病毒方面，外周血標(biāo)本檢出率更高，腺病毒肺泡灌洗液和血mNGS同時(shí)可以檢出。

但由于mNGS操作程序復(fù)雜，對(duì)環(huán)境和人員要求較高，難以在基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，且檢測(cè)成本高，不推薦作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，主要用于重癥感染、難以治愈的慢性感染、復(fù)雜/混合感染和免疫缺陷患兒感染的診斷[30]。

另外，m NGS檢測(cè)過(guò)程混雜因素較多，不同的方法、平臺(tái)、質(zhì)控都可能影響結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)流程有待統(tǒng)一。

綜上所述，傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測(cè)手段如培養(yǎng)、涂片因敏感性和時(shí)效性差，不利于呼吸系統(tǒng)感染性疾病早期臨床診斷和治療。

呼吸道感染病原體抗原或抗體檢測(cè)的多聯(lián)檢測(cè)時(shí)效性高，可用于早識(shí)別感染，并指導(dǎo)抗感染藥物的合理使用。

快速分子檢測(cè)的發(fā)展在很大程度上有助于加快呼吸系統(tǒng)感染性疾病的診斷，是對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的有效補(bǔ)充，但不能完全替代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。

mNGS檢測(cè)對(duì)呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是疑難、急危重癥及混合感染診斷等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

在臨床應(yīng)用上，可以將傳統(tǒng)的涂片、培養(yǎng)、抗原、抗體等檢測(cè)方法與分子檢測(cè)方法相結(jié)合，發(fā)揮優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而快速、準(zhǔn)確識(shí)別呼吸道病原體、指導(dǎo)臨床治療。